アルツハイマー病に関連するMARK4変異はタウ蓄積を促進し、神経変性を悪化させる

PCR

 アルツハイマー病はタウ蛋白のリン酸化により凝集能が高まり脳内に蓄積することで神経変性を起こすことが知られています。タンパク質のリン酸化酵素であるMicrotubule-affinity regulating kinase 4(MARK4)はタウ蛋白もリン酸化しますが、変異型MARK4であるMARK4ΔG316E317Dはリン酸化だけでなく、タウ蛋白の不溶性と凝集能を促進させることにより、神経変性をより進行させることが判明しました。本記事では、MARK4変異がアルツハイマー病進行機序の一つになりうる論文をまとめました。

J Biol Chem. 2020 Oct 5; jbc. RA120.014420. doi: 10.1074/jbc.RA120.014420.

要旨

 微小管関連タンパク質であるタウの蓄積はアルツハイマー病(AD)と関連している。AD脳では、タウは多くの部位で異常にリン酸化されており、Ser262とSer356でのリン酸化がタウの蓄積と毒性に重要な役割を果たしている。Microtubule-affinity regulating kinase 4(MARK4)はこれらの部位でタウをリン酸化し、MARK4のリンカー領域における二重de novo変異(突然変異)のΔG316E317DはADのリスク上昇と関連している。しかし、この変異がタウのリン酸化、凝集、蓄積にどのように影響し、タウ誘発神経変性にどのように影響するのかは不明なままである。今回筆者らは、MARK4ΔG316E317Dが高リン酸化された不溶性のタウ蛋白を増加させ、Ser262/356依存性および非依存性のメカニズムを介して神経変性を悪化させたことを報告する。ヒトMARK4を発現させたショウジョウバエを用いて、MARK4とMARK4ΔG316E317Dを共発現させたところ、MARK4wtとMARK4ΔG316E317Dの共発現は、タウの総量を増加させ、タウ誘発神経変性を促進すること、MARK4ΔG316E317DはMARK4wtよりも強力な効果を示すことを明らかにした。興味深いことに、MARK4wtとMARK4ΔG316E317Dのin vitroキナーゼ活性は類似していた。また、Ser262およびSer356におけるタウのリン酸化をアラニン置換により阻害した場合、MARK4wtはタウの蓄積を促進せず、神経変性を悪化させなかったが、MARK4ΔG316E317Dを共発現させた場合には、タウの蓄積を促進した。また、MARK4wtとMARK4ΔG316E317Dはともにタウのオリゴマー型を増加させたが、MARK4ΔG316E317Dのみが生体内でのタウの不溶性をさらに増加させていた。

mark4変異
東京都立大学Webページより

背景

 微小管関連タンパク質タウの蓄積は、ADや他の神経変性疾患の病理学的な特徴である。タウは本来、折り畳まれていないタンパク質であり、翻訳後の修飾がオリゴマー化と凝集のプロセスに影響を与えている。タウタンパク質は多くのキナーゼによって複数の部位でリン酸化されている。その中でも、Par-1/ Microtubule-affinity regulating kinase (MARK)ファミリーに属するキナーゼは、Ser262とSer356の微小管結合リピート内でタウをリン酸化する。これらの部位でのタウのリン酸化は、微小管結合、細胞内局在、タンパク間相互作用を制御している。リン酸化されたタウは、前神経原線維変化に見られ、より高い集積播種能を持つことから、タウの異常の開始に関与していると考えられている。

 哺乳類には4つのPar-1/MARKファミリーメンバーであるMARK1-4が存在する。MARK4の制御異常は、ADの病因に関係していると考えられている。MARK4の発現はAD患者の脳で上昇しており、その活性は初期の病理学的変化と一致している。MARK4はin vitroでタウ凝集を増強させ、有意な一塩基多型(SNP)がADの局所的ベイズゲノムワイド関連解析(GWAS)でMARK4にマップされている。重要なことは、二重アミノ酸変異(ΔG316、E317D)をもたらすMARK4のde novo変異が、早期発症ADのリスク上昇と関連していることである。

 タウを変異型MARK4と共発現させた場合、野生型MARK4と共発現させた場合よりもSer262でのリン酸化が高いことから、この変異が異常にリン酸化されたタウの産生を促進することでADのリスクを高めることが示唆されている。しかし、この変異がMARK4のタウ代謝および毒性に対してどのような影響をもたらすのか完全には解明されていない。

 本研究では、ショウジョウバエモデルを用いて、ΔG316, E317D変異を有するMARK4(MARK4ΔG316E317D)のタウ蓄積および毒性に対する影響を、野生型MARK4(MARK4wt)と比較した。その結果、MARK4ΔG316E317Dを共発現させることで、高度にリン酸化された不溶性のタウ蛋白が増加し、新たなタウ蓄積と毒性が増強されることが明らかになった。

結果

MARK4ΔG316E317Dはリン酸化されたタウレベルを増加させ、MARK4wtよりもタウ毒性を促進した。

 生体内でのタウ代謝および毒性に対するMARK4wtおよびMARK4ΔG316E317Dの効果の違いを評価するために、Gal4応答性UAS配列の制御下でヒトMARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dを有するトランスジェニックフライを樹立した。網膜でMARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dをヒトタウと共発現させた。ウエスタンブロット法により、これらのハエは、MARK4wtおよびMARK4ΔG316E317Dを同程度のレベルで発現していることを確認した。MARK4はSer262およびSer356でタウをリン酸化し、Par-1によるSer262およびSer356でのタウリン酸化がタウを安定化させ、総タウレベルを増加させることを以前に報告した。MARK4wtおよびMARK4ΔG316E317Dの両方とも、総タウのレベルを増加させるとともに、Ser262およびSer356でリン酸化されたタウのレベルを増加させた。

 抗p-Ser262タウ抗体および抗p-Ser356タウ抗体は、対応する部位でリン酸化されていないタウ蛋白を検出しない。MARK4ΔG316E317DによるSer356でのタウリン酸化の著明な増加は、このモデルにおけるPAR-1/MARK活性を反映している。MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dの共発現は、タウのmRNAレベルに影響を与えなかったことから、タウレベルの増加は、タウ転写遺伝子の転写上昇によるものではないことが示された。

 次に、MARK4の共発現がタウ毒性に及ぼす影響を解析した。眼におけるヒトタウの発現は、視神経の最初のシナプス神経突起である篩状板において、加齢に依存した進行性の神経変性を引き起こす。また、タウとMARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dを共発現させたハエは、タウのみを発現させたハエに比べて、篩状板においてより多くの神経変性を示すことを発見した。さらに、MARK4ΔG316E317Dを共発現させた場合、MARK4wtを共発現させた場合よりも顕著な神経変性が認められた。

 一方、MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dを単独で発現させても、タウを発現させない場合には、同年齢での神経変性は認められなかった。これらの結果は、MARK4ΔG316E317Dがタウのリン酸化および蓄積を促進し、MARK4wtよりも強くタウの毒性を悪化させることを示唆している。

MARK4wtおよびMARK4ΔG316E317Dは、in vitroで類似のキナーゼ活性を有する。

 以前の研究では、HEK293細胞にタウとMARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dを共導入した場合、MARK4ΔG316E317Dを導入した細胞は、MARK4wtを導入した細胞と比較して、タウのSer262リン酸化能が有意に増加したことが報告されている。これは、MARK4のde novo変異が、Ser262上のタウをより効率的にリン酸化するMARK4の能力を増強させる証拠として解釈された。しかし、MARK4ΔG316E317DがMARK4wtよりも高いキナーゼ活性を有するかどうかはまだ検証されていない。この可能性を探るために、筆者らはin vitroキナーゼアッセイを行った。具体的には、HEK293細胞でMARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dを発現させ、細胞溶解物からMARK4タンパク質を免疫沈降させ、組換えタウを基質としたキナーゼ活性を測定した。MARK4wtとMARK4ΔG316E317Dは同程度のキナーゼ活性を有しており、MARK4ΔG316E317Dを発現する細胞におけるタウ蓄積量の増加は、キナーゼ活性の違いによるものではないことが示唆された。

MARK4ΔG316E317Dは、MARK4wtではなく、Ser262/356に依存しない方法でタウレベルを上昇させ、タウの毒性を悪化させる。

 筆者らは、Par-1 の過剰発現が Ser262 と Ser356 のリン酸化を介してタウの蓄積を引き起こし、神経変性を促進することを報告している。MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dによるタウ蓄積および毒性の悪化が、Ser262およびSer356でのタウリン酸化を介しているかどうかを調べるために、これらの両方の部位がアラニン(S2A)で置換されているタウ変異体を用いた。Par-1と同様に、MARK4wtの発現はS2Aタウレベルを増加させなかった。また、MARK4wtはS2Aタウによる神経変性を悪化させないことも明らかにした。これらの結果は、MARK4wtがSer262およびSer356でのタウリン酸化を介してタウレベルを上昇させ、タウの毒性を増加させることを示唆している。対照的に、MARK4ΔG316E317DはS2Aタウのレベルを有意に増加させ、MARK4ΔG316E317DとS2Aタウの共発現は神経変性を悪化させた。これらの結果から、MARK4ΔG316E317Dの共発現は、Ser262とSer356のリン酸化を伴わない新規の機能獲得機構を介して、タウレベルとタウ毒性を増加させることが示唆された。

MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dの発現はタンパク質全体の分解を阻害しない

 筆者らは、MARK4ΔG316E317Dが、タウのmRNAレベルに影響を与えることなく、タウタンパク質レベルを増加させることを見出した。MARK4ΔG316E317Dによるタウの蓄積のメカニズムを調べるために、この効果がタウタンパク質に特異的であるかどうかを調べた。ホタルルシフェラーゼと共発現させた場合、MARK4ΔG316E317Dはルシフェラーゼレベルを増加させず、この変異体タンパク質が外因性に発現したタンパク質の非特異的蓄積を引き起こさないことを示した。

 次に、MARK4ΔG316E317Dがオートファジー活性を阻害するかどうかを調べた。MARK4は、mTOR複合体1(mTORC1)をネガティブに調節することが知られている。mTORC1は、タウを含む様々なタンパク質の分解を媒介するオートファジーの保存的調節因子である。MARK4wtとMARK4ΔG316E317Dの発現がmTORシグナル伝達に異なる影響を与えるかどうかを調べるために、MARK4ΔG316E317Dの発現がmTORシグナル伝達に影響を与えるかどうかを調べた。ハエ網膜におけるMARK4wtまたはMARK4ΔG316E317DはTORシグナルを阻害する。また、MARK4wtもMARK4ΔG316E317DもTORの標的であるS6Kのリン酸化に影響を与えなかった。また、MARK4wtおよびMARK4ΔG316E317Dは、LC3-II/LC3-I比およびオートファジー基質Ref2Pのレベルに影響を与えず、オートファジー活性は低下していないことが示唆された。これらの結果は、MARK4ΔG316E317Dがタンパク質分解の全体的な抑制とは別のメカニズムでタウの蓄積を引き起こすことを示唆している。

MARK4ΔG316E317Dは、生体内でのタウの総量とリン酸化量を増加させるが、付加部位ではタウを直接リン酸化しない。

 タウの高リン酸化はタウ病理と相関しているので、筆者らはMARK4ΔG316E317Dが全体的なタウリン酸化レベルを増加させるかどうかを調べた。筆者らは、タウのリン酸化状態の包括的な定量的プロファイリングのためにPhos-tag解析を使用した。ショウジョウバエは、Par-1/MARKファミリーの単一メンバーであるPar-1を発現している。筆者らは以前に、Par-1がヒトのタウタンパク質をSer262およびSer356でリン酸化し、それらを安定化し、他の部位でのその後のリン酸化を促進することを報告した。このモデルにおけるタウリン酸化に対するMARK4wtとMARK4ΔG316E317Dの効果の違いを強調するために、Par-1ノックダウン下でこの実験を行った。ハエの網膜で発現したタウタンパク質は、複数のバンドに分離し、複数のパターンでリン酸化されていることを示した。興味深いことに、MARK4wtとMARK4ΔG316E317Dのどちらを共発現させたかによって、発現量が増加するタウのリン酸化形態が異なることがわかった。MARK4wtは移動速度の速いバンドの強度を増加させ、MARK4ΔG316E317Dを共発現させた場合は移動速度の遅いバンドの強度をさらに増加させ、変異体タンパク質が生体内でのリン酸化によりタウ蛋白量を増加させていることを示した。

 タウは多くのセリンおよびスレオニン部位とプロリン部位を有しており、これらの部位はGSK3β、MAPK、サイクリン依存性キナーゼ5(Cdk5)などのプロリン指示型Ser/Thrキナーゼ(SP/TPキナーゼ)によってリン酸化されている。Par-1はこれらの部位を直接リン酸化しないが、Par-1の過剰発現は、タウレベルの全体的な増加をもたらし、SP/TP部位でリン酸化されるタウの比例的な増加をもたらす。MARK4ΔG316E317DがMARK4wtよりも大きな範囲でSP/TP部位でリン酸化されたタウの蓄積を促進するかどうかを決定するために、以下のSP/TP部位でリン酸化されたタウに対するリン酸化特異抗体を用いてウエスタンブロットを行った。AT8 (Ser202, Thr205)、AT180 (Thr231)、PHF1 (Ser396, Ser404)にリン酸化されたタウに対するリン酸化特異抗体を用いてウエスタンブロットを行った。タウとMARK4wtの共発現は、これらの部位でリン酸化されたタウのレベルを増加させ、タウとMARK4ΔG316E317Dの共発現は、タウ単独の発現と比較して、これらのレベルをさらに増加させた。これらのSP/TP部位はMARK4の直接の基質であるとは考えられず、phospho-SP/TP-tau種の増加は総タウ量の増加に比例していることから、MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dの共発現によるphospho-SP/TP-tauの上昇は総タウの蓄積の結果である可能性が高いことが示唆される。

 しかし、ΔG316E317Dの変異がキナーゼの基質特異性を変化させ、MARK4ΔG316E317DがSP/TP部位をリン酸化するのではないかと考えた。MARK4ΔG316E317Dがこれらの部位を直接リン酸化するかどうかを決定するために、インビトロアッセイを行った。組換えタウをMARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dとインキュベートし、Phos-tag法を用いてタウのリン酸化パターンを解析した。タウは、MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dとインキュベートした場合でも同様のリン酸化パターンを示した。このことは、MARK4ΔG316E317Dが、生体内で間接的なメカニズムを介してSP/TP部位でリン酸化されたタウの蓄積を増加させることを示唆している。

MARK4wtおよびMARK4ΔG316E317Dはともにタウの二量体およびオリゴマーを増加させ、MARK4ΔG316E317Dはさらにタウの不溶性形態の蓄積を促進する。

 タウは蓄積しやすい高次構造に凝集することができ、SP/TP部位でのタウのリン酸化はこのプロセスを促進する。そこで、筆者らは、MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dの共発現が、二量体やオリゴマーのような小さな凝集体の形成に影響を与えるかどうかを調べた。ショウジョウバエ網膜に発現するタウタンパク質は、ほとんどが単量体で存在している。筆者らは、MARK4wtおよびMARK4ΔG316E317Dの両方が、二量体およびオリゴマーのレベルを同様の範囲で増加させることを発見した。

 次に、MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dの共発現がタウの界面活性剤不溶性に影響を与えるかどうかを評価するために、順次抽出を行い、次いで抗タウ抗体を用いたウエスタンブロットを行った。以前に報告されているように、ショウジョウバエ網膜のタウタンパク質は、ほとんどが界面活性剤に溶ける形で存在している。単独で発現した場合、またはMARK4wtやMARK4ΔG316E317Dと共発現させた場合、タウはNP-40を含むRIPA緩衝液でほとんど抽出された。しかし、タウをMARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dと共発現させた場合、SDS可溶性画分中にタウタンパク質が存在し、この効果はMARK4ΔG316E317Dを発現させた場合により顕著であった。タウは、MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dのいずれかと共発現させた場合、界面活性剤不溶性画分には検出されなかった。

 タウタンパク質はLaemmli SDS-PAGEでいくつかのバンドに移行し、これらのバンドの移行速度はそのリン酸化レベルに関係している。筆者らは以前、移動速度の遅いバンド(tau-upper)のタウは、移動速度の速いバンド(tau-lower)のタウよりもSP/TPサイトでリン酸化されることが多いことを報告した。NP-40画分のタウ種は、SDS画分に蓄積されたタウタンパク質がtau-upperとtau-lowerの両方を含んでいるのに対し、大部分がtau-lowerであった。phosopho-SP/TPタウ蛋白の蓄積と一致して、MARK4ΔG316E317Dの共発現は、SDS可溶性画分中のtau-upperのレベルを増加させた。

 さらに、MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dとの共発現がS2Aタウの溶解性に影響を与えるかどうかを解析した。野生型のタウとは対照的に、MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317DDのいずれかの共発現の有無にかかわらず、S2Aの二量体およびNP-40不溶性形態は検出されなかった。S2Aオリゴマーは検出されたが、MARK4wtまたはMARK4ΔG316E317DのいずれかではS2Aオリゴマーを増加させなかった。これらの結果は、MARK4ΔG316E317DがS2Aタウの不溶性を増加させる以外のメカニズムでS2Aタウの蓄積を促進していることを示唆している。

 これらの結果をまとめると、MARK4wtは、Ser262/356リン酸化タウ、二量体、およびオリゴマーのレベルを増加させることが示された。一方、MARK4ΔG316E317Dは、これらのタウ蛋白だけでなく、不溶性のタウ蛋白の蓄積を促進し、神経変性を促進する可能性がある。

考察

 Par-1/MARKは、タウの異常が病気の発症に関与していることが示唆されている。筆者らは、Par-1を過剰発現させると、タウリン酸化が増加し、ノックダウンするとタウリン酸化が減少することを報告し、タウリン酸化はタウ蓄積と神経変性の増悪を引き起こすことを明らかにした。本研究では、ヒトMARK4wtがpTauSer262、pTauSer356、総タウのレベルを増加させ、タウの毒性を増加させることを明らかにした。このことから、MARK4wtはPar-1と同様に、S2Aのタウリン酸化を介してタウの代謝と毒性に影響を与えていることが示唆された。一方、MARK4ΔG316E317Dは付加的なメカニズムを介してタウ蓄積を促進することを見出した。MARK4ΔG316E317Dは、S2Aタウのレベルを増加させたことから、Ser262またはSer356でリン酸化されていない豊富なタウ蛋白を増加させていることが示唆された。また、MARK4ΔG316E317Dは凝集型のタウの蓄積を引き起こすことも明らかにした。

 これらの結果は、MARK4wtがSer262および356でリン酸化されたタウの蓄積を促進し、MARK4ΔG316E317Dがさらなるメカニズムを介してタウの蓄積をさらに増加させることを示唆している。MARK4ΔG316E317Dは界面活性剤不溶性のタウの蓄積を促進するが、このモデルのタウはほとんどが界面活性剤不溶性の形態で存在することを考えると、MARK4ΔG316E317Dはタウのミスフォールディングを促進するだけでなく、他の未解明のメカニズムを介してタウの総量を増加させる可能性がある。また、MARK4ΔG316E317Dを共発現させることで、S2Aタウの溶解性に影響を与えることなく、S2Aタウ量を増加させることができるメカニズムが存在することを示唆した。

 Rovelet-Lecruxらは、HEK293細胞にタウとMARK4wtまたはMARK4ΔG316E317Dのいずれかで共導入した場合、MARK4ΔG316E317Dで導入した細胞は、MARK4wtと比較してSer262でのタウリン酸化の有意な増加を示したことを報告している。この研究の著者らは、MARK4におけるこのde novo変異は、Ser262上のタウをリン酸化するMARK4の機能増加をもたらすと結論づけた。またMARK4ΔG316E317Dを共発現させることにより、ハエの目において、MARK4wtと比較して、Ser262でリン酸化されたタウがより広範囲に増加することを示した。しかしながら、インビトロキナーゼアッセイは、MARK4wtおよびMARK4ΔG316E317Dがキナーゼ活性に有意な差を示さなかったことを明らかにし、タウの蓄積がMARK4ΔG316E317Dによるタウのより効率的なリン酸化の結果であるという考えに反論した。

 二重変異(ΔG316E317D)は、キナーゼを基質や調節因子と結びつける短いリンカーに位置している。予測された立体構造は、二重アミノ酸の変化(ΔG316E317D)が基質結合領域の面積を増加させ、MARK4と相互作用するタンパク質との強い結合を促進することを示唆している。MARK4は、細胞骨格タンパク質、キナーゼやホスファターゼ、ユビキチン関連酵素、シグナル伝達分子、mRNA結合タンパク質、転写メディエーターなど、様々なタンパク質と相互作用することが報告されています。MARK4の変異は、相互作用するタンパク質への親和性を変化させ、その結果、タウの蓄積に有利な条件を作り出す可能性がある。MARK4ΔG316E317Dとタウ以外の基質との相互作用が強化されたこと、あるいは新規の基質が間接的にタウを安定化する可能性がある。  ADに加えて、MARK4は虚血性軸索損傷やシヌクレイン病を含む他の神経変性疾患においても重要な役割を果たすことが示唆されている。病的条件下では、リンカー領域における翻訳後修飾の追加などのMARK4の異常は、MARK4上のΔG316E317D変異と同様の効果を引き起こし、それによってタウおよび他の凝集しやすいタンパク質のミスフォールディングを促進する可能性がある。タウ蓄積を促進するMARK4のΔG316E317D誘導性変化の発見は、散発性ADの病態におけるMARK4の制御異常についての洞察を提供する可能性がある。